熒光探針定量PCR技術(shù)原理及應(yīng)用
熒光探針定量PCR技術(shù)原理及應(yīng)用
PCR技術(shù)是通過對基因的選擇性片段進行體外高效擴增，實現(xiàn)目的基因的檢測。熒光探針定量PCR（FQ-PCR）是一種新的基因定量檢測技術(shù)，國外文獻多用“實時定量PCR（real time quantitative PCR）”或“TaqMan PCR(以美國PE公司商標命名) ”。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標記探針，巧妙地把核酸擴增（PCR）、雜交及光譜技術(shù)結(jié)合在一起，從而實現(xiàn)了對目的基因的準確定量檢測，正發(fā)展成為臨床實驗診斷的常規(guī)技術(shù)。
1.原理
FQ-PCR的工作原理[1-3]是利用Taq酶的5’ → 3’外切酶活性，在PCR反應(yīng)系統(tǒng)中加入一個熒光標記的探針。該探針可與引物包含序列內(nèi)的DNA模板發(fā)生特異性雜交，探針的5’端標以熒光報告基團FAM（6-羧基熒光素，熒光發(fā)射峰值在518mm處），靠近3’端標以熒光淬滅基團TAMRA(6-羧基四甲基諾丹明,熒光發(fā)射峰值在582nm處)，兩者之間構(gòu)成能量傳遞結(jié)構(gòu)。當探針保持完整時，5’端熒光報告基團所激發(fā)出的熒光信號被3’端淬滅基因吸收或抑制，不出現(xiàn)熒光信號變化。當PCR反應(yīng)體系中有目的基因存在，就會擴增出特異核酸片段，熒光探針即會根據(jù)堿基配對的原理與之雜交。當PCR進入延伸（復(fù)制）期，Tap酶從引物3’端開始,隨新鏈延伸沿DNA模板移動，當移動到探針結(jié)合的位置時，其5’→ 3’端外切酶活性作用，將探針切斷（切口平移效應(yīng)）。熒光報告基團和淬滅基團間的能量傳遞結(jié)構(gòu)被破壞，淬滅基團的淬滅作用被解除，熒光報告基團的熒光信號釋放出來（圖1）。PCR反應(yīng)每復(fù)制一個特異核酸片段，就有一個探針被切斷，伴隨一個熒光信號的釋放。由于被釋放的熒光基團數(shù)目和PRC產(chǎn)物是一對一的關(guān)系，因此用熒光檢測技術(shù)檢測出的熒光信號有無或強弱，即代表擴增產(chǎn)物有無或多少。由于熒光信號是代表擴增產(chǎn)物的有效特異信號，無需進行有效和無效信號分離，實現(xiàn)了儀器實時檢測(圖2)，為新的PCR定量原理創(chuàng)造了條件。
圖1.TaqMan PCR反應(yīng)模式
（A）聚合反應(yīng)：（B）鏈置換；（C）裂解；
（D）聚合完成（R：FAM；Q：TAMRA；FP：上游引物；RP：下游引物）
圖2.FQ-PCR實時動力學(xué)曲線
ABI公司首先根據(jù)上述原理研制了ABI 7700 等系列定量PCR儀，在PCR反應(yīng)中設(shè)置標準模板系列（一般5~7個標準濃度）反應(yīng)管和空白對照管。通過實時檢測反應(yīng)管中的熒光信號，計算出RQ+、RQ-、△RQ。RQ+代表樣品管熒光報告基團發(fā)光強度與淬滅基團發(fā)光強度的比率，RQ-代表空白管中二者的比率，△RQ（△RQ = RQ+-RQ-）代表PCR過程中熒光信號變化量。當熒光信號增強到某一閾值（根據(jù)熒光信號基線的平均值和標準差，計算出以99.7%的置信度大于平均值作為閾值）時，標準模板反應(yīng)管所用的循環(huán)次數(shù)（Ct值）就被記錄下來。Ct值與標準模板數(shù)量的對數(shù)值之間有嚴格的線性關(guān)系[3]，利用系列標準模板的Ct值，制成標準曲線(圖3)，根據(jù)待測樣品的Ct值，就可在標準曲線中確定待測樣品起始的DNA數(shù)量。根據(jù)數(shù)據(jù)處理，即可得出定量結(jié)果。探針設(shè)計一般應(yīng)符合以下條件[2]：①探針長度應(yīng)在20~40個堿基左右，以保證結(jié)合的特異性。②GC堿基含量在40%~60%，避免單核苷酸序列的重復(fù)。③避免與引物發(fā)生雜交或重疊。④探針與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度要大于引物與模板結(jié)合的穩(wěn)定程度，因此探針的Tm值要比引物的Tm值至少高出5℃。另外，探針的濃度，探針與模板序列的同源性，探針與引物的距離都對實驗結(jié)果有影響。
圖3.FQ-PCR 標準曲線
2. 技術(shù)特點
2.1 封閉狀態(tài)下檢測，避免了擴增產(chǎn)物污染而致的假陽性
傳統(tǒng)PCR于反應(yīng)結(jié)束后取出反應(yīng)液，通過電泳染色和紫外儀觀察結(jié)果。擴增產(chǎn)物在開放狀態(tài)下分析，對實險室的污染是不可避免的。因污染而導(dǎo)致假陽性，成為PCR臨床實驗診斷技術(shù)應(yīng)用一個難以逾越的障礙。FQ-PCR在全封閉狀態(tài)下實現(xiàn)PCR擴增和產(chǎn)物分析，完全杜絕了擴增產(chǎn)物污染而導(dǎo)致的假陽性。至于樣品間的污染，無論從目的基因的數(shù)量、濃度還是顆粒大小分析，都比較容易控制。我國PCR臨床應(yīng)用出現(xiàn)問題，產(chǎn)物污染所致假陽性是主要原因之一。
2.2 基因的定量檢測，擴展了臨床應(yīng)用空間
傳統(tǒng)PCR對基因的檢測只能定性，不能定量主要是由擴增產(chǎn)物積累的動力學(xué)所決定的：①PCR產(chǎn)物在擴增過程中呈指數(shù)積累，當產(chǎn)物增加到一定程度，產(chǎn)物就停止了指數(shù)積累。不同起始模板，其指數(shù)增長期所用的循環(huán)是不同的，因此，不同數(shù)量基因的樣品在同一循環(huán)次數(shù)中積累的產(chǎn)物不能作為樣品基因定量的依據(jù)；②PCR產(chǎn)物積累到一定程度就不能再增加，再進入平臺期。為了擴大PCR檢出的靈敏度通常要增加循環(huán)次數(shù)，循環(huán)次數(shù)增加使得樣品目的基因含量高的反應(yīng)管已進入平臺期，終產(chǎn)物量并不代表樣品目的基因含量；③PCR反應(yīng)的管間擴增效率差異總是存在的，既然PCR產(chǎn)物呈指數(shù)增長，由擴增效率差異引起的產(chǎn)物擴增差異也呈指數(shù)積累，增加循環(huán)次數(shù)勢必增加終產(chǎn)物的差異，而減少循環(huán)次數(shù)又降低了檢測的靈敏度。FQ-PCR采用實時檢測，使所有含有不同數(shù)量的目的基因均在同一條件（達到熒光閾值）下進行分析，因而更具有可比性。而且，這一條件處于擴增產(chǎn)物指數(shù)積累初期，合成產(chǎn)物所需的dNTP、酶、離子均處于飽和的最佳狀態(tài)，所以FQ-PCR循環(huán)參數(shù)與起始模板間有良好的線性關(guān)系（相關(guān)系數(shù)＞0.95），實現(xiàn)了極為精確的基因定量檢測。
2.3 光譜技術(shù)進一步提高了靈敏度
FQ-PCR 技術(shù)已用于單細胞基因診斷，靈敏度已達到極限水平，即檢測單拷貝基因，而傳統(tǒng)PCR是不易做到的。靈敏度提高得益于光譜技術(shù)。
2.4 熒光探針雜交，進一步提高了特異性
PCR 擴增中常會出現(xiàn)非特異性擴增和引物二聚體，從而影響了對特異電泳帶的判斷。FQ-PCR通過特異性探針雜交信號檢測PCR擴增產(chǎn)物，相當于PCR反應(yīng)過程中自動完成了Southern雜交，進一步提高目的基因檢測的特異性。
2.5 擴增與自動分析一體化，檢測更加簡便和快速
FQ-PCR通過計算機和分析軟件，使PCR擴增、產(chǎn)物檢測和定量分析一體化，比傳統(tǒng)定性PCR更為簡便和快速，同時也避免了傳統(tǒng)PCR產(chǎn)物分析中有害物質(zhì)對人體的影響，計算和數(shù)據(jù)處理也有利于科研和臨床資料的保存和分析。
3. 臨床應(yīng)用概要
科學(xué)研究已經(jīng)證明，人類疾病大都直接或間接與基因有關(guān)，臨床實驗醫(yī)學(xué)正進入基因診斷時代。但對于許多疾病的發(fā)生和發(fā)展來說，相關(guān)基因不是有無問題，而是一個從量變到質(zhì)變的過程，基因定量檢測更具有臨床意義。
3.1 感染性疾病
PCR在醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)中最有價值的應(yīng)用領(lǐng)域就是對感染性疾病的診斷。理論上，只要樣本有一個病原體存在，PCR就可以檢測到。一般實驗室也能檢出10~102基因拷貝，而目前病原體抗原檢測方法一般需要105-7個病原體才可檢測到。PCR對病原體的檢測解決了免疫學(xué)檢測的“窗口期”問題，可判斷疾病是否處于隱性或亞臨床狀態(tài)。
定量PCR研究資料已表明，病原體數(shù)量與感染性疾病病情的輕重程度、傳染性及治療效果均有相關(guān)性。許多研究表明，人類免疫缺陷病毒(HIV)感染后，潛伏期長短和臨床癥狀輕重與血液中的病毒量顯著相關(guān)；有也研究表明，HIV病毒載量低于一定值時，沒有傳染性。
在乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒定量研究中發(fā)現(xiàn)，病毒的數(shù)量與某些藥物的療效相關(guān)。例如，干擾素治療對肝炎病毒高拷貝者不敏感，低拷貝者敏感；而有些藥物則具有顯著降低病毒高拷貝的作
用。
3.2 腫瘤
盡管腫瘤發(fā)病的分子機制尚未完全清楚，但相關(guān)的基因的遺傳學(xué)改變的積累，是致癌性轉(zhuǎn)變的根本原因已被普遍接受。
癌基因的表達增加和突變，在許多腫瘤早期和良性的階段就可出現(xiàn)。PCR技術(shù)不但能有效的檢測基因的突變，而且能準確檢測癌基因的表達量，可據(jù)此進行腫瘤早期診斷、分型、分期和預(yù)后判斷。
幾乎所有慢性骨髓性白血病患者都可檢測到原癌基因易位導(dǎo)致的BCR/ABL融合基因形成，定量PCR技術(shù)可通過檢測BCR/ABL融合基因的表達確定微量殘余惡性細胞存在的數(shù)量，以此作為治療效果和估計復(fù)發(fā)的危險性的依據(jù)。
腫瘤標記物質(zhì)也是腫瘤診斷的熱門研究領(lǐng)域。目前臨床對此多用免疫學(xué)方法檢測，靈敏度低，一般需要達到108個分子數(shù)。用定量逆轉(zhuǎn)錄(RT)-PCR方法，一般條件下可檢出10-102某種標志物的mRNA，可大大提高檢出率。
一些病毒致癌作用也與病毒載量有關(guān)，EB病毒載量的FQ-PCR檢測結(jié)果已被用于鼻咽癌早期發(fā)現(xiàn)和隨訪。
3.3 遺傳病
PCR技術(shù)首次臨床應(yīng)用就是從檢測鐮狀細胞和β-地中海貧血的基因突變開始的。基因的突變和缺失均會引起各種珠蛋白的表達不平衡，用FQ-PCR檢測各種珠蛋白基因表達差異，是地中海貧血診斷的有效手段。
總之，除與疾病直接相關(guān)的基因檢測外，各種與疾病相關(guān)的細胞因子、激素、受體，用FQ-PCR方法檢測其基因表達水平具有更高的靈敏性，更有利于疾病診斷。
參考文獻
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廣州健侖生物科技有限公司病毒研究所
徐華
2014/03/05
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